猪肺炎支原体P65蛋白的克隆表达、单克隆抗体制备及阻断ELISA抗体检测方法建立

【摘要】猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasmapneumoniaeofswine,MPS)的病原,给养猪业造成巨大的经济损失。由于缺乏对具有良好免疫原性的Mhp特异性蛋白的深入研究,使得Mhp在致病机制、血清学检测方法和新型疫苗的研究发展上受到一定限制,从而影响了对MPS的控制。本试验利用原核表达系统表达了Mhp膜蛋白P65,并用该重组蛋白免疫小鼠,利用Mhp全菌蛋白和P65蛋白作为包被抗原进行ELISA筛选,制备抗P65单抗,然后使用该重组蛋白作为包被抗原,酶标单抗作为二抗,成功建立了单抗阻断ELISA检测方法。本研究主要从以下几个方面展开：1、根据GenBank公布的猪肺炎支原体(Mhp)P65基因序列,利用Primer5.0软件设计合成引物,通过PCR扩增目的基因,将含有三个稀有密码子的前922bp进行基因合成,剩余910bp通过PCR扩增出来,然后采用SOE-PCR方法将前段基因片段和后段基因片段连接起来,插入到表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)/P65.将重组质粒pET-32a(+)/P65导入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经1%IPTG诱导表达3h后,蛋白的表达量最高,并用ProtinoNi-TED2000PackedColumns进行亲和纯化,得到较纯的目的蛋白。Western-blot分析表明表达蛋白具有良好的反应原性。2、本研究利用重组P65蛋白作为免疫原,利用P65蛋白、Mhp168株F350代全菌蛋白、空载体蛋白筛选能分泌P65蛋白抗体的杂交瘤细胞株,经过3次亚克隆,获得了1株能稳定分泌抗P65蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为3G12。WesternBlot分析显示,3G12能与Mhp168株F350代全菌蛋白及大肠杆菌表达的P65重组蛋白产生反应,与空载体蛋白、猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinitis)蛋白不产生反应。亚型鉴定显示,该抗体的重链为IgGl,轻链为k链。采用间接ELISA测得3G12腹水与P65蛋白反应的效价为1：4000000,与168全菌蛋白反应的效价为1：25600,腹水经商品化的ProteinG蛋白柱纯化得到纯度较高的单抗。3、本研究将重组表达的蛋白P65作为包被抗原,把纯化的单抗进行HRP酶标作为二抗,通过优化其反应条件成功建立阻断ELISA方法。用酶标仪读取各孔OD450nm值,按照以下公式计算阻断率：阻断率(percentageinhibition/PI)=(阴性血清OD450nm值-被检血清OD450m值)/阴性血清OD450nm值×100%。通过对已知血清的检测,使用ROC标准曲线分析,当OD450为0.563,敏感性和特异性的和最大,即为临界值,此时阻断率为36.456%。当OD450<0.563时,血清为阳性；当OD450>0.563时,血清为阴性。同时试验证明,该方法与IDEXX试剂盒的符合率为92.92%,重复性较好,且与其他病原无交叉反应。可用于Mhp流行病学调查和疾病诊断。综上所述,本研究成功表达Mhp重组蛋白P65,获得了1株分泌MhpP65蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G12,并成功建立了单抗阻断ELISA方法,从而为进一步研究Mhp致病机理以及建立Mhp血清学诊断方法奠定基础。
【作者】张悦；
【导师】邵国青；姜平；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】猪肺炎支原体(Mhp)；P65蛋白；单克隆抗体；阻断ELISA方法；

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